Тестирование Bacillus subtilis в кормовых микробных препаратах
ИКС 65.120 Склассификационный №: B 46
ГБ/Т 26428-2010
пНациональные стандарты Китайской Республики
Стандарт тестирования на Bacillus subtilis в кормах
Дата выпуска: 14 января 2011 г.
Реализовано: 01.07.2011
Выдан:пГлавное управление по надзору за качеством, инспекции и карантину Китайской Республики и Китайский национальный комитет по управлению стандартизацией
Предисловие
Этот стандарт разработан в соответствии с положениями GB/T 1.1-2009.
Этот стандарт находится под юрисдикцией Национального технического комитета по стандартизации кормовой промышленности (SAC/TC 76).
Этот стандарт был предложен и разработан: Центром микробиологического анализа и тестирования провинции Гуандун.
Основными составителями этого стандарта являются: Хунхуэй Чжу, Сяотан Сунь, Сунчжэнь Ян, Юаньлян Чен и Сяньцзяо Чжан.
Тестирование Bacillus subtilis в кормовых микробных препаратах
1. Область применения
Этот стандарт определяет правила тестирования Bacillus subtilis в кормовых микробных препаратах.
Настоящий стандарт применим к испытаниям и расчетам содержания bacillus subtilis в кормовых микробных препаратах.
2. Нормативные ссылки
Следующие документы необходимы для применения настоящего документа. Для датированных ссылок к этому документу применяется только датированная версия. Для цитируемых документов без даты к этому документу применяется последняя версия (включая все поправки):
GB/T 8170 Правила числового округления, а также выражение и оценка предельных значений
GB/T 14699.1 Отбор проб кормов (GB/T 14699.1 – 2005, ISO 6497: 2002, IDT)
GB/T 20195 Корма для животных: подготовка проб (GB/T 20195 – 2006, ISO 6498: 1998, IDT)
3. Разбавители, среды и реагенты
Если не указано иное, в анализе должны использоваться только аналитически чистые реагенты и дистиллированная или деионизированная или эквивалентно чистая вода.
3.1. 0,85% стерилизованный физиологический раствор
3.2. Питательная агаровая (NA) среда, см. A.1 Приложения A
3.3. Раствор для окрашивания по Граму, см. А.2 Приложения А.
3.4. Питательная среда с 7% хлоридом натрия, см. А.3 Приложения А.
3.5. VP тестирование сред и реагентов, см. А.4 Приложения А
3.6. Среда восстановления нитратов и реагенты, см. А.5 Приложения А.
3.7. Среда для ферментации D-маннита, см. А.6 Приложения А.
3.8. Рабочая среда пропионата, см. А.7 Приложения А.
4. Оборудование и посуда
В дополнение к лабораторному оборудованию, обычно используемому в микробиологии, другое оборудование и стеклянная посуда перечислены ниже:
4.1. Термостатический инкубатор: 37 ºC ± 1 ºC
4.2. рН-метр, точность ± 0,1 ед.
4.3. Стеклянная или пластиковая чашка Петри
4.4. Пипетка со шкалой с маркировкой вместимостью 1 мл и 10 мл, с минимальной шкалой 0,1 мл и 0,5 мл соответственно
4.5. Стеклянный или пластиковый стержень
4.6. Микроскоп с 1000-кратным увеличением
5. Выборка
Тестовые образцы являются реальными и репрезентативными. Инструменты для отбора проб, такие как лопатки, ложки, пробирки, банки, ножницы и т. д., должны быть стерилизованы.
Образцы должны быть отправлены в комнату микробиологических испытаний как можно скорее. Размер и метод отбора проб должны быть реализованы в соответствии с GB/T 14699.1.
6. Подготовка образцов
Подготовка образца должна осуществляться в соответствии с GB/T 20195, и образец должен быть проверен как можно скорее после подготовки.
7. Порядок работы
7.1. Подготовка проб для проверки, первоначальное суспензирование и десятикратное разбавление.
Используя асептические операции и условия, взвешивают 25 г (мл) образца, добавляют 225 мл 0,85% стерилизованного физиологического раствора, гомогенизируют в течение 1-2 мин и делают исходную суспензию 1:10. Затем набирают 1 мл исходной суспензии 1:10, добавляют 9 мл 0,85% стерилизованного физиологического раствора и тщательно перемешивают до разведения 1:100. В зависимости от бактериального состава образца далее делают десятикратное последовательно увеличивающееся разведение.
7.2. Прививка и культура
Выбрать 2-3 подходящих разведения, выдержать 10 мин на водяной бане при температуре 80°С ± 1°С, набрать 0,1 мл стерильной пипеткой и засеять две чашки с питательным агаром (3.2). Используйте стержень для покрытия, чтобы нанести инокулят на поверхность агара как можно аккуратнее и быстрее. Стержень для покрытия не должен касаться края чашки Петри. Используйте стерильный стержень для покрытия каждой чашки. Накройте чашку Петри с покрытием и дайте ей постоять при комнатной температуре в течение 15 мин, чтобы инокулят полностью впитался в агар. Переверните планшет и поместите в инкубатор при температуре 37 °С ± 1 °С на 48 ± 2 часа.
7.3. Подсчет колоний и скрининг
После инкубации выберите чашку с количеством колоний от 30 до 300. Если в чашке вырастают крупные хлопьевидные колонии, то она не заявлена к использованию. Однако, если хлопьевидные колонии составляют менее половины чашки, а распределение колоний в оставшейся половине очень равномерное, можно подсчитать половину количества колоний в чашке и умножить результат на 2, чтобы представить общее количество колоний в чашке. Колония типичной Bacillus subtilis шероховатая, непрозрачная, неблестящая, с расширенными краями, округлая или волнистая, неправильной формы, серовато-белого или желтоватого цвета. Наконец, выберите 5 колоний, которые имеют эти характеристики для подтверждения эксперимента.
7.4. Подтверждающее тестирование
7.4.1. Обзор
В настоящее время, если культуральная среда, используемая в коммерческих наборах для биохимической идентификации или пробирках для биохимической идентификации, такая же, как и среда, используемая при тестировании на подтверждение настоящего стандарта, эти наборы или пробирки можно использовать в соответствии с инструкциями к товарам для проведения этого подтверждения. эксперимент.
7.4.2. Подготовка штамма
Выберите одну колонию из чашки Петри, высейте культуру штрихом на чашку с питательным агаром и культивируйте при температуре 37 ± 1 °С в течение 48 ± 2 часов. Из каждой чашки следует взять по крайней мере одну хорошо изолированную характерную колонию, нанести ее штрихом на чашку с агаром и сохранить для подтверждающего тестирования.
7.4.3. Морфологическое наблюдение
Отобранные очищенные колонии исследовали с помощью микроскопии с окрашиванием по Граму (3.3). Клетки Bacillus Subtilis должны быть палочковидными, со спорами овальной формы, мезозойскими или близкими к мезозою, цисты не должны быть значительно увеличены.
7.4.4. Физиохимическое подтверждающее тестирование
Очищенные колонии отбирали для тестирования: роста 7% хлорида натрия (3.4), тестирования VP (3.5), восстановления нитратов (3.6), ферментации D-маннита (3.7) и использования пропионата (3.8).
7.4.5. Подтверждение результатов
Подтверждение результатов приведено ниже:
1. Колонии Bacillus subtilis имеют шероховатую поверхность, непрозрачные, серовато-белые или желтоватые на вид, палочковидные со спорами овальной формы, мезозойские или околомезозойские, с цистами, которые значительно не увеличены.
2. Результаты теста положительны для роста 7% хлорида натрия, тестирования VP и восстановления нитратов.
3. Кислота может быть получена путем ферментации D-маннита.
4. Его можно судить и определить как Bacillus subtilis без использования пропионата.
Отличительные характеристики Bacillus Subtilis и Bacillus-подобных бактерий показаны ниже в таблице 1.
Таблица 1. Отличительные черты Bacillus subtilis и Bacillus-подобных бактерий
| Б. Субтилис | Б. Лихениформис | Б. Цереус | Б. Коагуляны | Б. Твердый | Б. Медленный | Б. Мегатериум | Б. Пумилус | |
Анаэробный рост |
|
|
|
|
|
|
|
| |
|
|
|
|
|
|
|
|
| |
Снижение нитратов |
|
|
|
|
|
|
|
| |
Гидролиз крахмала |
|
|
|
|
|
|
|
| |
Сжижение желатина |
|
|
|
|
|
|
|
| |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
| |
Кислота Производство |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
| |
|
|
|
|
|
|
|
|
| |
7% роста хлорида натрия |
|
|
|
|
|
|
|
| |
рН 5,7 Рост |
|
|
|
|
|
|
|
| |
Примечание:+ = положительный;- = отрицательный;г = Некоторые штаммы положительны;нет данных = Не определено | |||||||||
8. Расчет результатов и отчет
8.1. Подсчет числа колоний Bacillus subtilis на каждой чашке.
Рассчитайте количество колоний Bacillus subtilis (а) на каждое блюдо по Формуле 1:
Формула 1
а =(б ÷ А) х С
Легенда:
а:Количество колоний Bacillus subtilis на каждой чашке;
б:Количество колоний, подтвержденных как колонии Bacillus subtilis после отбора проб;
А:Количество колоний, выбранных для подтверждения (5);
С:Количество колоний на чашке, воплощающее отличительные признаки сенная палочка
Окончательный результат(а) следует округлить до ближайшего целого числа в соответствии с правилами округления чисел в GB/T 8170.
Например:
Если на чашке имеется в общей сложности 78 колоний, обладающих характеристиками Bacillus Subtilis, 5 отбираются для подтверждающего тестирования, а 4 из них являются колониями Bacillus Subtilis, то:
а= (4 / 5) х 78 = 62,4
а= 62,4 ~ 62
Согласно правилам числового округления в GB/T 8170, количество колоний Bacillus subtilis (а) на этом блюде 62.
8.2. Количество колоний Bacillus subtilis в образце: метод расчета и отчет
Выберите 2 чашки для серийных разведений (каждое разведение должно иметь по крайней мере одну чашку с подтвержденным количеством Bacillus Subtilis от 30 до 300 на чашке), рассчитайте по формуле 2, что соответствует 1 мл или 1 г Bacillus Subtilis в образце. , Н.
Формула 2
Н = Ʃа / V · (n1 + 0,1н2) · д
Легенда:
Н:Общее количество Bacillus subtilis в образце;
Ʃа:Общая сумма подтвержденных Bacillus subtilis во всех блюдах;
В:Посевной объем чашки, мл;
н1:Количество чашек для первого разведения;
н2:Количество чашек для второго разведения;
д:Коэффициент разбавления первого разбавления (значениегдля неразбавленных образцов 1).
Окончательный результат (N) должен быть округлен до двух ближайших значащих цифр в соответствии с правилами округления чисел в GB/T 8170. Количество колоний Bacillus subtilis в образце также может быть записано в научной записи (1,0–9,9 умножить на 10).Икс).
Укажите оценочное количество Bacillus subtilis на мл или г образца, КОЕ/г или КОЕ/мл.
Пример 1:
Если после первого разведения (10-3), подтвержденное количество колоний Bacillus subtilis составляет 168 и 215 соответственно, а после второго разведения (10-4), подтвержденное количество колоний Bacillus subtilis составляет 34 и 35 соответственно, тогда:
N = (168 + 215 + 34 + 35) / [0,1 х (2 + 0,1 · 2) х 10-3]
N = 472/0,00022
N = 2145450 ~ 2100000
Согласно правилам числового округления в GB/T 8170, оценочное количество Bacillus subtilis в образце в этом примере в единицах г или мл составляет 2 100 000 КОЕ/г (или мл), или 2,1 x 106 КОЕ/г (или мл).
Пример 2:
Если последнее разведение (10-4) подтверждает, что количество колоний Bacillus subtilis равно 120 и 130 соответственно, тогда:
N = (120 + 130) / (0,1 х 2 х 10-4)
N = 250/0,00002
N = 12500000 ~ 12000000
Согласно правилам числового округления в GB/T 8170, оценочное количество Bacillus subtilis в образце в этом примере в единицах г или мл составляет 12000000 КОЕ/г (или мл), или 1,2 x 107 КОЕ/г (или мл).
